Potencial de la cepa CPA-8 de Bacillus subtilis como agente de biocontrol de enfermedades de postcosecha de fruta
Fecha de publicación
2012-01-18Autor/a
Yánez Mandizábal, Viviana del Rocío
Otros autores/as
Universitat de Lleida. Departament de Tecnologia d'Aliments
Cita recomendada
Yánez Mandizábal, Viviana del Rocío.
(2012)
.
Potencial de la cepa CPA-8 de Bacillus subtilis como agente de biocontrol de enfermedades de postcosecha de fruta.
Universitat de Lleida.
L-328-2012
;
http://hdl.handle.net/10803/80456.
Metadatos
Mostrar el registro completo del ítemLa limitació en l’ús de fungicides per al control de malalties en postcollita de fruita és una
problemàtica d’elevada magnitud en el sector fructícola actual. Degut a això l’ús d’estratègies
alternatives com el control biològic microbià són fonamentals per a la producció de fruita de
qualitat. Malgrat tot, el desenvolupament de programes de biocontrol eficaços requereix d’un
coneixement profund de la capacitat de control i els mecanismes d’acció utilitzats per l’agent
microbià que es pretén emprar, així com de la possibilitat per a què aquest pugui ésser produït
i formulat a nivell comercial. En aquest context, la bactèria Bacillus subtilis soca CPA–8 aïllada
de la superfície de nectarines al Laboratori de Patologia de Postcollita del Centre IRTA
(Lleida) ha demostrat tenir una bona capacitat de biocontrol de malalties de postcollita de
fruita de pinyol. El seu futur ús a nivell comercial depèn de l’estudi del seu potencial de
biocontrol de malalties de postcollita de fruita; així com del desenvolupament de processos
per a l’optimització de la producció i formulació.
La present tesi tenia com a objectiu principal avaluar aspectes clau per al desenvolupament de
B. subtilis CPA–8 com agent efectiu per al control biològic de malalties de postcollita de fruita.
Per a complir amb aquest objectiu, en primer lloc, es va dur a terme una anàlisi detallada de les
característiques biològiques de la soca CPA–8 com ara el seu creixement en medi de cultiu,
producció d’endòspores i substàncies antifúngiques; així com el seu potencial per al control de
malalties importants en postcollita de taronja, poma i fruita de pinyol (Capítol 1). Amb aquests
resultats, el següent pas fou estudiar el mode d’acció utilitzat per B. subtilis CPA–8 per a la
supressió de patògens de postcollita, concretament contra Monilinia spp. causant de la
podridura marró en fruita de pinyol (Capítol 2). Mitjançant la combinació d’eines d‘anàlisi
químic, moleculars i biològiques es van determinar els principals factors implicats en la
capacitat antagònica de la soca CPA–8 contra Monilinia spp. El pas següent fou optimitzar la
producció de B. subtilis CPA–8, en aquest sentit es va desenvolupar un medi de cultiu de baix
cost que proporcionés un creixement alt i mantingués l’eficàcia de biocontrol (Capítol 3).
Primer es van buscar fonts de nitrogen i de carboni econòmiques entre productes comercials i
subproductes agroalimentaris. Posteriorment es va dur a terme l’escalat de la producció de la
bactèria en un bioreactor de 5 L i es va comprovar l’efectivitat per al control de Monilinia spp.
en préssecs. El pas final fou la formulació de B. subtilis CPA–8 mitjançant l’assecat per
atomització (Capítols 4 i 5). Aquest mètode fou seleccionat per dos motius, d’una banda
perquè aquesta és una tècnica d’assecat viable per a formulació de bactèries a baix cost i per
l’altra banda en base als resultats obtinguts en el capítol 1 sobre la capacitat de la bactèria per
produir endòspores resistents al calor i efectives contra patògens de postcollita de fruita.
Primer es va dur a terme un estudi comparatiu de l’efecte de l’atomització sobre la
supervivència de B. subtilis CPA–8 i de l’agent de biocontrol Pantoea agglomerans CPA–2
(Capítol 4). Posteriorment es va realitzar una avaluació de les substàncies protectores/material
de suport més adequades per a l’atomització de la soca CPA–8, i amb els millors productes
atomitzats es van avaluar diferents medis de rehidratació i l’activitat antifúngica; així com la
vida útil y l’efectivitat durant l’emmagatzemament (Capítol 5)
Els resultats obtinguts en el capítol 1 demostraren que B. subtilis CPA–8 produeix cèl lules,
endòspores resistents al calor i compostos que tenen una alta activitat antagònica in vitro
contra els principals patògens de postcollita de fruita Botrytis cinerea, Monilinia laxa, Monilinia
fructicola, Penicillium digitatum, Penicillium italicum i Penicillium expansum. Els tractaments de
cèl lules, endòspores y sobrenedants lliures de cèl lules de la soca CPA–8 mostraren diferents
nivells d’efectivitat per al control de podridures en taronja, poma i fruita de pinyol, presentant
els millors resultats contra Monilinia spp. en préssecs i nectarines amb reduccions de la
incidència de la malaltia fins al 100 %. L’assaig de dosis de diferents tractaments de la soca
CPA–8 a 108, 107 i 106 UFC mL–1 foren efectius contra Monilinia spp. de forma semblant o
millor al Serenade Max®.
L’estudi del mode d’acció de B. subtilis CPA–8 (Capítol 2) va demostrar que els sobrenedants
lliures de cèl lules provinents de cultius líquids tenen una alta activitat antifúngica in vitro
contra Monilinia spp. similar a l’observada amb suspensions cel lulars. Les anàlisis mitjançant
PCR i bioautografia en TLC d’extractes butanòlics d’aquests sobrenedants en comparació
amb els de les soques de referència de B. subtilis UMAF6614 i UMAF6639, van revelar la
producció de les principals famílies de lipopèptids antifúngics coneguts en Bacillus (fengicines,
iturines i surfactines), fet que apuntava l’antibiosi com a principal mecanisme d’acció implicat
en la capacitat de biocontrol de B. subtilis CPA–8. Les fraccions corresponents a les fengicines
foren les responsables de l’activitat inhibitòria de la soca CPA–8 enfront de Monilinia spp.
Aquests resultats van ser corroborats definitivament mitjançant la construcció de mutants de
B. subtilis CPA–8 defectius per a la producció de fengicina interrompent l’expressió del gen
fenB. Les anàlisis per PCR i bioautografia en TLC revelaren que els mutants defectius de la
soca CPA–8 perdien la capacitat d’inhibir a Monilinia spp. per la seva incapacitat per a produir
fengicines. Els assaigs d’efectivitat en fruita utilitzant tractaments provinents dels mutants de
la soca CPA–8 van demostrar que aquests havien perdut la capacitat de controlar la podridura
causada per Monilinia spp. amb percentatges d’incidència similars als observats en el control
sense tractar, mentre que els tractaments amb la soca parental o Serenade Max® presentaven
reduccions de la malaltia de fins el 100 %. Tots aquests resultats demostraren que la producció
de fengicines juga un paper molt important en l’efectivitat de B. subtilis CPA–8 per a controlar
la podridura marró del préssec; i que aquest resulta ser el principal mode d’acció implicat en la
seva capacitat de biocontrol.
En l’optimització de la producció de B. subtilis CPA–8 (Capítol 3) els resultats obtinguts van
demostrar que és possible aconseguir alts nivells de biomassa (superiors a 3×109 UFC mL–1)
emprant dos medis de baix cost composats per farina de soja desengreixada 44 % a 40 g L–1
com a font de nitrogen en combinació amb sacarosa a 20 g L–1 o melassa a 5 g L–1 com a fonts
de carboni. A més a més, la producció de la soca CPA–8 en aquest medi de baix cost va poder
ser escalada a nivell de laboratori en un bioreactor de 5 L de capacitat a 30 °C, amb agitació de
200 rpm i flux d’aire de 100 L h–1, mantenint les concentracions de la bactèria a
3×109 UFC mL–1. Els assaigs en fruita amb tractaments de la soca CPA–8 crescuda en el medi
optimitzat de baix cost van demostrar que aquesta mantenia la seva eficàcia de biocontrol
contra M. fructicola en préssecs amb reduccions de la malaltia de fins al 95 %, similar als tractaments de la bactèria crescuts en medis de laboratori. Les poblacions de CPA–8 van
sobreviure en ferides de préssecs inoculats, independentment dels medis de cultiu utilitzats.
Aquests resultats proporcionen una base fiable per a la producció de la soca CPA–8 a nivell
industrial.
En la formulació de B. subtilis CPA–8 mitjançant assecat per atomització (Capítols 4 i 5) els
resultats demostraren que aquesta bactèria és capaç de sobreviure a les altes temperatures del
procés (32.3 % de viabilitat i 3.3×109 UFC g–1 de concentració final de producte), comparada
amb P. agglomerans CPA–2 utilitzada com a model de bactèria sensible a la calor i no
formadora d’endòspores que no fou resistent (menys del 2 % de viabilitat). La supervivència
de la soca CPA–8 a l’atomització va estar directament relacionada amb la seva capacitat per a
produir endòspores resistents a les altes temperatures. La resistència a la calor de la soca
CPA–8 a més a més va dependre de la fase de creixement, essent el cultiu de 72 h, més
resistent que el de 24 h, probablement pel seu major contingut d’endòspores.
Els resultats obtinguts en l’estudi de la substància protectora/material de suport més adequada
per a l’atomització de B. subtilis CPA–8 van demostrar que quatre diferents combinacions de
llet desnatada en pols i MgSO4 proveïen una bona recuperació de pols (28–38 %) i continguts
d’humitat del 7–13 %. La supervivència de la soca CPA–8 fou diferent en els atomitzats dels
cultius de 24 i 72 h. Les formulacions de 72 h mostraven una major supervivència (28–32 %)
y amb concentracions finals al voltant d’1.6–3.3×109 UFC g–1, mentre que la viabilitat dels
atomitzats de 24 h fou inferior a l’1 %, fet pel qual les primeres van seleccionar–se per a la
seva posterior avaluació. Diferents rehidratants como l’aigua o el tampó fosfat van
proporcionar una bona recuperació de cèl lules viables en les formulacions de CPA–8 similars
a les obtingudes amb llet desnatada en pols o sacarosa al 10 % amb el que es dedueix que
l’aigua pot utilizar–se com a rehidratant amb l’avantatge a nivell pràctic que això suposa.
L’estudi de la vida útil de les formulacions de la soca CPA–8 emmagatzemades a 4 °C (fred) i
a 20 °C (temperatura ambient) va demostrar que la viabilitat es mantenia o disminuïa
lleugerament (0.2–0.3 log) durant 6 mesos d’emmagatzematge. A més a més, després de 4 i
6 mesos de conservació aquestes formulacions controlaven la podridura marró causada per
Monilinia spp. en nectarines i préssecs mostrant reduccions de la incidència de la malaltia entre
el 90 i 100 %. Els resultats obtinguts van demostrar que l’atomització podria ser un mètode
d’assecat adequat per a obtenir formulacions estables i efectives de B. subtilis CPA–8.En conclusió els estudis realitzats en aquesta tesi demostren el potencial de l’antagonista
B. subtilis CPA–8 per al control de malalties de postcollita de fruita i estableixen les bases per a
la seva posterior implementació de la producció i formulació a nivell comercial.
Proyectos de investigación europeos
Colecciones
- Tesis Doctorals [1313]