Yánez Mandizábal, Viviana del Rocío. (2012) . Potencial de la cepa CPA-8 de Bacillus subtilis como agente de biocontrol de enfermedades de postcosecha de fruta. Universitat de Lleida. L-328-2012 ; http://hdl.handle.net/10803/80456.

La limitació en l’ús de fungicides per al control de malalties en postcollita de fruita és una problemàtica d’elevada magnitud en el sector fructícola actual. Degut a això l’ús d’estratègies alternatives com el control biològic microbià són fonamentals per a la producció de fruita de qualitat. Malgrat tot, el desenvolupament de programes de biocontrol eficaços requereix d’un coneixement profund de la capacitat de control i els mecanismes d’acció utilitzats per l’agent microbià que es pretén emprar, així com de la possibilitat per a què aquest pugui ésser produït i formulat a nivell comercial. En aquest context, la bactèria Bacillus subtilis soca CPA–8 aïllada de la superfície de nectarines al Laboratori de Patologia de Postcollita del Centre IRTA (Lleida) ha demostrat tenir una bona capacitat de biocontrol de malalties de postcollita de fruita de pinyol. El seu futur ús a nivell comercial depèn de l’estudi del seu potencial de biocontrol de malalties de postcollita de fruita; així com del desenvolupament de processos per a l’optimització de la producció i formulació. La present tesi tenia com a objectiu principal avaluar aspectes clau per al desenvolupament de B. subtilis CPA–8 com agent efectiu per al control biològic de malalties de postcollita de fruita. Per a complir amb aquest objectiu, en primer lloc, es va dur a terme una anàlisi detallada de les característiques biològiques de la soca CPA–8 com ara el seu creixement en medi de cultiu, producció d’endòspores i substàncies antifúngiques; així com el seu potencial per al control de malalties importants en postcollita de taronja, poma i fruita de pinyol (Capítol 1). Amb aquests resultats, el següent pas fou estudiar el mode d’acció utilitzat per B. subtilis CPA–8 per a la supressió de patògens de postcollita, concretament contra Monilinia spp. causant de la podridura marró en fruita de pinyol (Capítol 2). Mitjançant la combinació d’eines d‘anàlisi químic, moleculars i biològiques es van determinar els principals factors implicats en la capacitat antagònica de la soca CPA–8 contra Monilinia spp. El pas següent fou optimitzar la producció de B. subtilis CPA–8, en aquest sentit es va desenvolupar un medi de cultiu de baix cost que proporcionés un creixement alt i mantingués l’eficàcia de biocontrol (Capítol 3). Primer es van buscar fonts de nitrogen i de carboni econòmiques entre productes comercials i subproductes agroalimentaris. Posteriorment es va dur a terme l’escalat de la producció de la bactèria en un bioreactor de 5 L i es va comprovar l’efectivitat per al control de Monilinia spp. en préssecs. El pas final fou la formulació de B. subtilis CPA–8 mitjançant l’assecat per atomització (Capítols 4 i 5). Aquest mètode fou seleccionat per dos motius, d’una banda perquè aquesta és una tècnica d’assecat viable per a formulació de bactèries a baix cost i per l’altra banda en base als resultats obtinguts en el capítol 1 sobre la capacitat de la bactèria per produir endòspores resistents al calor i efectives contra patògens de postcollita de fruita. Primer es va dur a terme un estudi comparatiu de l’efecte de l’atomització sobre la supervivència de B. subtilis CPA–8 i de l’agent de biocontrol Pantoea agglomerans CPA–2 (Capítol 4). Posteriorment es va realitzar una avaluació de les substàncies protectores/material de suport més adequades per a l’atomització de la soca CPA–8, i amb els millors productes atomitzats es van avaluar diferents medis de rehidratació i l’activitat antifúngica; així com la vida útil y l’efectivitat durant l’emmagatzemament (Capítol 5) Els resultats obtinguts en el capítol 1 demostraren que B. subtilis CPA–8 produeix cèl lules, endòspores resistents al calor i compostos que tenen una alta activitat antagònica in vitro contra els principals patògens de postcollita de fruita Botrytis cinerea, Monilinia laxa, Monilinia fructicola, Penicillium digitatum, Penicillium italicum i Penicillium expansum. Els tractaments de cèl lules, endòspores y sobrenedants lliures de cèl lules de la soca CPA–8 mostraren diferents nivells d’efectivitat per al control de podridures en taronja, poma i fruita de pinyol, presentant els millors resultats contra Monilinia spp. en préssecs i nectarines amb reduccions de la incidència de la malaltia fins al 100 %. L’assaig de dosis de diferents tractaments de la soca CPA–8 a 108, 107 i 106 UFC mL–1 foren efectius contra Monilinia spp. de forma semblant o millor al Serenade Max®. L’estudi del mode d’acció de B. subtilis CPA–8 (Capítol 2) va demostrar que els sobrenedants lliures de cèl lules provinents de cultius líquids tenen una alta activitat antifúngica in vitro contra Monilinia spp. similar a l’observada amb suspensions cel lulars. Les anàlisis mitjançant PCR i bioautografia en TLC d’extractes butanòlics d’aquests sobrenedants en comparació amb els de les soques de referència de B. subtilis UMAF6614 i UMAF6639, van revelar la producció de les principals famílies de lipopèptids antifúngics coneguts en Bacillus (fengicines, iturines i surfactines), fet que apuntava l’antibiosi com a principal mecanisme d’acció implicat en la capacitat de biocontrol de B. subtilis CPA–8. Les fraccions corresponents a les fengicines foren les responsables de l’activitat inhibitòria de la soca CPA–8 enfront de Monilinia spp. Aquests resultats van ser corroborats definitivament mitjançant la construcció de mutants de B. subtilis CPA–8 defectius per a la producció de fengicina interrompent l’expressió del gen fenB. Les anàlisis per PCR i bioautografia en TLC revelaren que els mutants defectius de la soca CPA–8 perdien la capacitat d’inhibir a Monilinia spp. per la seva incapacitat per a produir fengicines. Els assaigs d’efectivitat en fruita utilitzant tractaments provinents dels mutants de la soca CPA–8 van demostrar que aquests havien perdut la capacitat de controlar la podridura causada per Monilinia spp. amb percentatges d’incidència similars als observats en el control sense tractar, mentre que els tractaments amb la soca parental o Serenade Max® presentaven reduccions de la malaltia de fins el 100 %. Tots aquests resultats demostraren que la producció de fengicines juga un paper molt important en l’efectivitat de B. subtilis CPA–8 per a controlar la podridura marró del préssec; i que aquest resulta ser el principal mode d’acció implicat en la seva capacitat de biocontrol. En l’optimització de la producció de B. subtilis CPA–8 (Capítol 3) els resultats obtinguts van demostrar que és possible aconseguir alts nivells de biomassa (superiors a 3×109 UFC mL–1) emprant dos medis de baix cost composats per farina de soja desengreixada 44 % a 40 g L–1 com a font de nitrogen en combinació amb sacarosa a 20 g L–1 o melassa a 5 g L–1 com a fonts de carboni. A més a més, la producció de la soca CPA–8 en aquest medi de baix cost va poder ser escalada a nivell de laboratori en un bioreactor de 5 L de capacitat a 30 °C, amb agitació de 200 rpm i flux d’aire de 100 L h–1, mantenint les concentracions de la bactèria a 3×109 UFC mL–1. Els assaigs en fruita amb tractaments de la soca CPA–8 crescuda en el medi optimitzat de baix cost van demostrar que aquesta mantenia la seva eficàcia de biocontrol contra M. fructicola en préssecs amb reduccions de la malaltia de fins al 95 %, similar als tractaments de la bactèria crescuts en medis de laboratori. Les poblacions de CPA–8 van sobreviure en ferides de préssecs inoculats, independentment dels medis de cultiu utilitzats. Aquests resultats proporcionen una base fiable per a la producció de la soca CPA–8 a nivell industrial. En la formulació de B. subtilis CPA–8 mitjançant assecat per atomització (Capítols 4 i 5) els resultats demostraren que aquesta bactèria és capaç de sobreviure a les altes temperatures del procés (32.3 % de viabilitat i 3.3×109 UFC g–1 de concentració final de producte), comparada amb P. agglomerans CPA–2 utilitzada com a model de bactèria sensible a la calor i no formadora d’endòspores que no fou resistent (menys del 2 % de viabilitat). La supervivència de la soca CPA–8 a l’atomització va estar directament relacionada amb la seva capacitat per a produir endòspores resistents a les altes temperatures. La resistència a la calor de la soca CPA–8 a més a més va dependre de la fase de creixement, essent el cultiu de 72 h, més resistent que el de 24 h, probablement pel seu major contingut d’endòspores. Els resultats obtinguts en l’estudi de la substància protectora/material de suport més adequada per a l’atomització de B. subtilis CPA–8 van demostrar que quatre diferents combinacions de llet desnatada en pols i MgSO4 proveïen una bona recuperació de pols (28–38 %) i continguts d’humitat del 7–13 %. La supervivència de la soca CPA–8 fou diferent en els atomitzats dels cultius de 24 i 72 h. Les formulacions de 72 h mostraven una major supervivència (28–32 %) y amb concentracions finals al voltant d’1.6–3.3×109 UFC g–1, mentre que la viabilitat dels atomitzats de 24 h fou inferior a l’1 %, fet pel qual les primeres van seleccionar–se per a la seva posterior avaluació. Diferents rehidratants como l’aigua o el tampó fosfat van proporcionar una bona recuperació de cèl lules viables en les formulacions de CPA–8 similars a les obtingudes amb llet desnatada en pols o sacarosa al 10 % amb el que es dedueix que l’aigua pot utilizar–se com a rehidratant amb l’avantatge a nivell pràctic que això suposa. L’estudi de la vida útil de les formulacions de la soca CPA–8 emmagatzemades a 4 °C (fred) i a 20 °C (temperatura ambient) va demostrar que la viabilitat es mantenia o disminuïa lleugerament (0.2–0.3 log) durant 6 mesos d’emmagatzematge. A més a més, després de 4 i 6 mesos de conservació aquestes formulacions controlaven la podridura marró causada per Monilinia spp. en nectarines i préssecs mostrant reduccions de la incidència de la malaltia entre el 90 i 100 %. Els resultats obtinguts van demostrar que l’atomització podria ser un mètode d’assecat adequat per a obtenir formulacions estables i efectives de B. subtilis CPA–8.En conclusió els estudis realitzats en aquesta tesi demostren el potencial de l’antagonista B. subtilis CPA–8 per al control de malalties de postcollita de fruita i estableixen les bases per a la seva posterior implementació de la producció i formulació a nivell comercial.